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    本發明提供了用於擴增HLA-C基因2、3與4號外顯子的方法以及該方法中所使用的特異性引子對。本發明還提供了HLA-C基因分型的方法以及該方法中所使用的擴增引子對。
    公开号:TW201300543A
    申请号:TW100148367
    申请日:2011-12-23
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Jian Li；shi-ping Chen；Cai-Fen Zhang
    申请人:Bgi Shenzhen Co Ltd；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    HLA-C基因分型的方法及其相關引子
    本發明涉及分子生物學領域，具體而言，本發明涉及用於HLA-C基因分型的方法，以及該方法中所使用的特異性引子。
    人類白血球抗原(human leucocyte antigen,HLA)是人類免疫系統的重要組成部分，也是目前所知人體最複雜的遺傳多態性系統。根據其結構、組織分佈和功能等方面的特點，HLA分子可分為HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ和HLA-Ⅲ等三類分子，其中HLA-Ⅰ類分子和HLA-Ⅱ類分子功能主要與免疫排斥相關，HLA-Ⅲ類分子功能主要與免疫相關的部分補體系統以及炎症相關因子等的合成相關；臨床移植研究發現，移植物的長期存活率與供者和受者雙方的HLA-Ⅰ和HLA-Ⅱ分子的匹配程度呈正相關性，當供受雙方的HLA分子的匹配程度越高，移植物的長期存活率就越高。
    其中HLA-C基因座屬於經典的HLA-Ⅰ類基因，位於HLA-A、B基因座之間，編碼HLA-C分子，其基因長度約3 Kb，由7個內含子和8個外顯子組成。近年來，隨著HLA基因分型技術的不斷發展，人們逐漸發現HLA-C和HLA-A、B分子一樣，具有高度多態性，並證實了HLA-C分子在臨床移植中的重要性。
    目前國際標準的HLA分型技術包括PCR-SSP(PCR-Sequence Specific Primer，聚合酶鏈反應-序列特異性引子)、PCR-SSO(PCR-Sequence Specific Oligonucleotide，聚合酶鏈反應-序列特異性寡核苷酸)和PCR-SBT(PCR-Sequencing Based Typing，聚合酶鏈反應-以定序為基礎的分型)。
    HLA-SSP的原理是設計出一整套等位基因組特異性引子，借助PCR技術獲得HLA型特異的擴增產物，通過電泳分析決定HLA型。HLA-SSO的原理是設計HLA型特異的寡核苷酸序列作為探針，把PCR產物標記，以PCR產物(待檢測基因DNA)與探針雜交。通過檢測螢光信號判斷HLA型。HLA-SSP和HLA-SSO的檢測信號均是模擬信號，解析度一般只能到達中低水準且都不能檢測新的等位基因。
    基於Sanger法定序的HLA-SBT是一種通過對PCR擴增後的DNA產物直接進行Sanger法定序(毛細管微電泳)，測定核酸序列，從而判斷HLA基因型的高解析分型方法，其具有直觀、高解析且能檢測新的等位基因的特點。但基於Sanger法定序的HLA-SBT整個實驗流程複雜、通量低和實驗成本高等缺點使其很難應用於大規模HLA高解析分型項目。
    基於以Illumina Solexa和Roche 454為代表的第二代定序技術(以下簡稱新定序技術)的HLA-SBT也是一種通過對PCR擴增後的DNA產物直接測定核酸序列，從而判斷HLA基因型的高解析分型方法，其除了原有直觀、高解析且能檢測新等位基因的特點外，還具有單分子定序、實驗流程簡單、高通量和低成本的特點。但與第一代定序技術(以Sanger法定序原理為基礎的定序技術)相比，能用於新定序技術定序基因庫製備的DNA長度不能太長(當前Illumina Solexa的最大適用長度為700 bp)，且新定序技術讀長普遍偏短，當前Illumia GA雙向讀長最大能達到300 bp。
    鑒於新定序技術的特點，PCR產物的長度不宜超過700 bp，原基於Sanger法定序方法的HLA-SBT的PCR引子不再適用。因此，有必要設計一套保守性和特異性良好且PCR產物長度滿足新定序技術要求的引子。 發明概要
    為了將第二代定序技術用於HLA-C基因分型，本發明提供了用於擴增HLA-C基因的2、3和4號外顯子的2套各3對PCR引子，它們分別是表1中顯示的序列辨識編號：1和2、3和4以及5和6；表2中顯示的序列辨識編號：7和8、9和10以及11和12。該等2套各3對PCR引子具有良好的保守性和特異性，並且可覆蓋HLA-C基因座2、3和4號外顯子全長序列，PCR產物長度均小於700 bp，滿足正常Illumina Solexa定序要求。另外，本發明的引子還適用於Sanger法定序。進一步地，本發明的引子還可以與其它HLA基因擴增引子一起使用。

    本發明還提供了一種新的HLA-C基因2、3和4號外顯子擴增方法，其特徵在於使用本發明的擴增引子對進行PCR擴增，該等擴增引子對的序列示於表1和表2。
    由於能夠通過PCR反應擴增出HLA-C的2、3和4號外顯子，因此，本發明的方法特別有利地可用於進行HLA-C基因分型。與現有的HLA-C基因分型方法相比，由於使用本發明的方法和擴增引子的產物被控制在700 bp以內，因此在進一步進行分型時，可以利用基於Illumina Solexa定序技術的HLA-SBT。
    本發明還提供了一種對樣品中的HLA-C基因2、3和/或4號外顯子進行定序的方法，其包括下列步驟：
    (1)　提供一個樣品並抽取該樣品的DNA；
    (2)　將本發明的引子對，優選地選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2、序列辨識編號：3和序列辨識編號：4、序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對用於擴增該DNA從而得到PCR產物，優選對PCR產物進行純化；以及
    (3)　對該PCR產物進行定序，該定序優選是通過第二代定序法，該第二代定序法是例如Illumina Solexa或Roche454。
    本發明還提供了一種HLA-C基因分型方法，其包括：
    (1)　使用本發明的引子對，優選地選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2、序列辨識編號：3和序列辨識編號：4、序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對進行PCR擴增，擴增待測樣本的HLA-C基因2、3和/或4號外顯子；以及
    (2)　對擴增出的外顯子進行定序，並將定序結果與資料庫中的標準序列進行比較，從而確定基因分型結果，其中該定序是通過Sanger定序法，或者是通過第二代定序法，該第二代定序法是例如Illumina Solexa或Roche454。
    在本發明上述方法中，還包括使用其它HLA基因擴增引子進行PCR擴增。
    另一方面，本發明還提供了一種用於進行HLA-C基因分型的試劑盒，該試劑盒中包括本發明的PCR擴增引子對，優選地選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2、序列辨識編號：3和序列辨識編號：4、序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對。在本發明的試劑盒中，進一步還可以包括其它HLA基因擴增引子。在一個實施方案中，該試劑盒還包含其它試劑，例如用於DNA擴增、DNA純化和/或DNA定序的試劑。
    應用本發明提供的擴增引子對和基因分型方法，能夠在擴增HLA-C的2、3和4號外顯子的基礎上進行基因分型。因此相對於現有技術而言，該分型利用了Illumina Solexa定序技術，提高了通量，簡化了流程，同時還節省了時間和成本。 較佳實施例之詳細說明
    提出以下實施例，以便使本領域熟習此項技術之人士更好地理解本發明，所述實施例僅出於例示性目的，並非意在限制本公開的範圍。
    本發明採用如下方法設計擴增HLA-C的2、3和4號外顯子的3對PCR引子。從IMGT/HLA網際網路網站下載所有最新HLA-C基因序列，然後保存到本地磁碟中作為HLA-C資料庫；同時下載所有最新非HLA-C的HLA-I類基因序列作為比較資料庫。將兩資料庫進行比較，在2、3和4號外顯子兩端和內部尋找各基因座保守和特異序列，並將設計的PCR引子序列與人類全基因組序列進行同源性比較。由於HLA-C基因與同屬於HLA-I類分子的其它基因具有很高的序列相似性，在設計PCR引子時儘量保證引子3’末端特異，確保引子擴增HLA-C基因的特異性。同時使PCR產物的長度小於700 bp，且正反引子的黏合溫度基本保持一致。將滿足設計要求的多對候選HLA-C引子用於擴增少數具有HLA-C常見血清型的模版DNA，從中篩選出保守性和特異性最好的，分別用於擴增HLA-C的2、3和4號外顯子的2套各3對PCR引子。
    本發明中涉及的DNA擴增方法、從樣品抽取DNA的方法、DNA純化方法和DNA序列比對的方法可以是本領域中的任何可用方法。該等方法可以由本領域熟習此項技術之人士根據具體情況進行選擇。對於DNA定序的方法，本領域熟習此項技術之人士可以根據常規的方法進行，或者根據定序儀器的使用說明書進行。
    例如，在利用二代定序技術進行定序過程中，可以使用5’末端添加引子標籤(primer index)序列的標籤引子進行，可以將擴增後的PCR產物進行打斷，並且打斷後產物進行末端修復並在其3’端連接去氧腺苷(A)，然後連接不同的PCR-free轉接子。
    在擴增引子前端連接一段標籤序列是為了實現同時對多個樣品進行定序。具體而言，可以結合PCR-index/barcode技術，通過在PCR引子的5’末端添加引子標籤(primer index)序列合成標籤引子，在PCR過程中對每個樣本引入獨特的引子標籤。這樣，在利用第二代DNA定序技術檢測過程中，除PCR環節必須逐個樣本處理外，其它實驗環節可把多個樣本混在一起同時處理，最終每個樣本的檢測結果可以通過其獨特的引子標籤序列找回。引子標籤的設計根據所應用的實驗平台不同而不同，考慮Illumina GA定序平台本身的特點，本發明在設計引子標籤時主要考慮了以下幾點：1：引子標籤序列中避免3個以上(包括3個)單鹼基重複序列，2：所有引子標籤的同一位址中鹼基A和鹼基C的總含量占所有鹼基含量的30%-70%之間，3：引子標籤序列本身的GC含量在40-60%之間，4：引子標籤之間序列差異度大於4個鹼基，5：引子標籤序列中避免出現與Illumina GA定序引子相似度高的序列，6：減少引子標籤序列添加到PCR引子上後，對PCR引子造成的嚴重髮夾(hairpin)、二聚物(dimer)情況的出現。
    術語“PCR-Free基因庫轉接子(adapter)”是指經設計的一段鹼基，其主要作用是輔助固定DNA分子在定序晶片上以及提供通用定序引子的結合位址，PCR-Free基因庫轉接子可以通過DNA連接酶將其直接連接至定序基因庫中的DNA片段兩端，轉接子的導入過程因為沒有PCR的參與，因此稱作PCR-Free基因庫轉接子。“轉接子(adapter)”或“基因庫轉接子(library adapter)”標籤技術是指通過對多個定序基因庫添加不同基因庫轉接子[不同基因庫轉接子的組成序列不同，序列不同的部分稱為轉接子標籤(adapter index)]，構建標籤定序基因庫，從而可實現多個不同標籤定序基因庫混合定序，且最終各個標籤定序基因庫的定序結果可相互區分的一種基因庫標籤技術。例如，本發明實施例中使用PCR-FREE基因庫轉接子來自ILLUMIA。
    在如下的實施例中，用篩選出的3對PCR引子，對95例已知HLA常見基因型的血樣品進行HLA-C基因座PCR擴增，擴增產物經Sanger法和第二代定序方法進行定序。將定序結果用於HLA-C分型，並通過與原分型結果比較來驗證PCR引子的保守性和特異性。 實施例1　用第二代定序技術(Illumina GA)進行HLA-C基因分型1.　樣本DNA抽取
    使用KingFisher自動抽取儀抽取95例已知HLA基因型的血樣品中抽取DNA。主要步驟如下：取出6個Kingfisher自動抽取儀配套的深孔板及1個淺孔板，依照說明書分別加入一定量配套的試劑並標記，將所有已加好試劑的孔板按要求置於相應的位置，選定程序“Bioeasy_200ul Blood DNA_KF.msz”程序，按下“start”執行該程序進行核酸抽取。程序結束後收集plate Elution中的100 ul左右的洗脫產物即為抽取的DNA，作為下一步PCR中的模版。 2.　PCR擴增
    通過合成5’末端具有不同引子標籤的PCR引子製作不同的PCR標籤引子，這些不同的PCR標籤引子可以用於不同的樣本，該等PCR引子是針對HLA-C的2、3和4號外顯子PCR引子，如表1所示。其後通過PCR反應在PCR產物兩端引入引子標籤，從而特異性標記來自不同樣本的PCR產物。
    以95套PCR標籤引子來分別擴增95份DNA樣本，每套PCR標籤引子由用於擴增HLA-C的2、3和4號外顯子的PCR引子(表1)和一對雙向引子標籤(表3)組成，其中每個正向PCR引子的5’末端上連接一對引子標籤的正向引子標籤，而反向PCR引子的5’末端上連接一對引子標籤的反向引子標籤。引子標籤在引子合成時直接添加在PCR引子的5’末端。
    把樣本抽取步驟中所得的95份DNA，依次編號1-95，PCR反應在96孔板中進行，共3板，編號分別為HLA-P-C2、HLA-P-C3、HLA-P-C4(C2/3/4表示擴增的基因座)，板內設置一個不添加模版的陰性對照，陰性對照所用引子與引子PI-96相同。實驗的同時，記錄下每對引子標籤對應的樣本編號資訊。


    將步驟1中以KingFisher自動抽取儀抽取的DNA為模版，以5’端帶有標籤的HLA-C各外顯子引子單管PCR擴增，PCR程序如下： C2：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→62℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置 C3：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→56℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置 C4：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→60℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置
    HLA-C的PCR反應系統如下：
    其中PInf-C-F2/3/4表示引子5’末端帶有第n號正向引子標籤序列(表3)的HLA-C的F引子，PInf-C-R2/3/4表示引子5’末端帶有第n號反向引子標籤序列(表3)的HLA-C的R引子(此處n≦96)，其它依此類推。且每個樣本對應特定的一套PCR引子。
    PCR反應在Bio-Rad公司的PTC-200 PCR儀上運行。PCR完成後，取2 ul PCR產物經1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖1顯示了前20個樣本HLA-C相應外顯子PCR產物電泳結果，DNA分子標記為DL 2000(Takara公司)，膠圖上有一系列片段大小為400 bp-500 bp單一條帶，表明這部分樣本的HLA-C各外顯子(C2、C3、C4)PCR擴增成功。其它樣品的結果與此類似。 3.　PCR產物混合和純化
    從96孔板HLA-P-C2剩餘的PCR產物中(陰性對照除外)各取20 ul混合在一個3 ml的EP管中，標記為HLA-C2-Mix，對其它2個96孔板進行同樣的操作，分別標記為HLA-C3-Mix和HLA-C4-Mix，震盪混勻，從HLA-C2-Mix、HLA-C3-Mix和HLA-C4-Mix中各取200 ul混合在一個1.5 ml的EP管中，標記為HLA-Mix，從HLA-Mix中取500 ul DNA混合物經Qiagen DNA Purification kit(QIAGEN公司)管柱純化(具體純化步驟詳見說明書)，純化所得的200 ul DNA，經Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司)測定HLA-Mix DNA濃度為50 ng/ul。 4.　Illumina GA PCR-Free定序基因庫的構建 4.1　PCR產物的打斷
    從純化後的HLA-Mix中取總量5 ug的DNA用 Covaris microTube with AFA fiber and Snap-Cap在Covaris S2(Covaris公司)上打斷。打斷條件如下：
    4.2　打斷後的PCR產物純化
    將HLA-Mix的所有打斷產物用QIAquick PCR Purification Kit回收純化，分別溶於37.5 ul的EB(QIAGEN Elution Buffer)中。 4.3　末端修復反應
    對純化的產物進行DNA末端修復反應，系統如下(試劑均購自Enzymatics公司)：
    反應條件為：在20℃下，在Thermomixer(Eppendorf公司)中溫浴30分鐘。
    反應產物經QIAquick PCR Purification Kit回收純化，溶於32 μl的EB(QIAGEN Elution Buffer)中。 4.4　3’末端加A反應
    上一步回收DNA的3’末端加A反應，系統如下(試劑均購自Enzymatics公司)：
    反應條件為：在37℃下，在Thermomixer中溫浴30分鐘。
    反應產物經MiniElute PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收純化，溶於38 μl的EB溶液(QIAGEN Elution Buffer)中。 4.5　連接Illumina GA PCR-Free基因庫轉接子(adaptor)
    加A後的產物連接Illumina GA PCR-Free基因庫轉接子，系統如下(試劑均購自Illumina公司)：
    反應條件為：在16℃下，在Thermomixer中溫浴過夜。
    反應產物經Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)純化後溶於50 ul去離子水，經螢光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結果如下：
    4.6　割膠回收
    取30μL HLA-Mix用2%低熔點瓊脂糖膠進行回收。電泳條件為100V，100分鐘。DNA標準分子量參照物為NEB公司的50 bp DNA Ladder。割膠回收400-750 bp長度範圍的DNA片段(圖2)。膠回收產物經QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收純化，純化後體積為32 ul，經螢光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結果為17.16 nM。 5.　Illumina GA定序
    根據QPCR檢測結果，取10 pmol DNA用Illumina GA PE-100程序定序，具體操作流程詳見Illumina GA操作說明書(Illumina GA Ⅱ x)。 6.　結果分析
    Illumina GA產出的定序結果是一系列DNA序列，通過查找定序結果中的正反引子標籤序列和引子序列，建立各個引子標籤對應樣本HLA-C各外顯子PCR產物定序結果的資料庫；通過BWA(Burrows-Wheeler Aligner)把各外顯子的定序結果定位在相應外顯子的參考序列上(參考序列來源：http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/)，並構建各個資料庫的一致性(consensus)序列；結合鹼基定序品質值和定序序列與一致性序列的差異度，對定序序列進行篩選和定序錯誤校正；以及校正後的DNA序列通過序列重疊(overlap)和連鎖(Pair-End連鎖)關係可組裝成HLA-C各外顯子相應的序列。圖3的截圖例示性說明了對1號樣品的HLA-C基因座的2號外顯子一致性序列進行構建的過程。
    將所定序的HLA-C內含子的DNA序列與IMGT HLA專業資料庫中HLA-C相應各外顯子的序列資料庫比對，序列比對結果100%匹配的即為對應樣本的HLA-C基因型。所有95個樣本，得到的分型結果與原已知分型結果完全相符，其中1-32號樣本的具體結果與樣本原來分型結果對比如下：(如表4所示，全部檢測結果與原有檢測結果相同)。

    註：HLA-C型中的C*0303不排除C*0320N的可能性，C*0401不排除C*0409N/0430的可能性，C*0702不排除C*0750的可能性，C*0801不排除C*0822的可能性，C*1505不排除C*1529的可能性，因為上述等位基因在HLA-C 2、3、4號外顯子的序列完全相同。 實施例2　用Sanger法定序進行HLA-C基因分型1.　樣品DNA抽取
    如實施例1中所述相似，以KingFisher自動抽取儀抽取的95例樣本中的26例已知HLA基因型的DNA。 2.　PCR擴增
    以上述KingFisher自動抽取儀抽取的DNA為模版，以C-F2、C-R2、C-F3、C-R3、C-F4、C-R4共3對PCR引子分別單管PCR擴增，各對引子PCR程序如下： C2：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→2℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置 C3：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→56℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置 C4：96℃　2分鐘
    95℃　30秒→60℃　30秒→72℃　20秒(35個循環)15℃　靜置
    HLA-C的PCR反應系統如下：
    PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測後(圖4)，準備純化。 3.　PCR產物純化
    利用millipore純化板進行PCR產物純化。基本步驟是：用記號筆在96孔PCR產物純化板上標記需要使用的孔，並向需要使用的孔中加入50 ul超純水，剩餘孔黏貼封口膜，室溫靜置15分鐘或連接到抽濾系統上，-10 Pa，5分鐘取下，每次從抽濾系統上取下純化板時都要在吸水紙上吸乾殘留在純化板底部排液口的液體。
    待純化PCR產物離心，4000 rpm，1分鐘；打開待純化PCR產物的蓋子或矽膠墊，每個PCR反應系統中加入100 ul超純水。然後把加入待純化PCR產物的純化板連接到抽濾系統上，調節真空度至氣壓表顯示-10 Pa，抽濾至純化板底部的微孔再生纖維膜上無液體，光照下觀察，無完整液面反射光澤。
    向有待純化PCR產物的孔中加50 ul超純水或TE到微孔再生纖維膜上；室溫下使用微量振盪器中檔振盪純化板5分鐘，轉移相應孔內全部液體至新的96孔PCR板對應的孔中。 4.　進行定序反應並純化定序反應產物
    以上述純化後的PCR產物為模版做定序反應定序反應的條件
    96℃　2分鐘
    96℃　10秒→55℃　5秒→60℃　2分鐘(25個循環)
    15℃　靜置
    定序反應的系統是：
    通過以下步驟純化定序反應產物：取下定序反應板配平，在3000 g下離心1分鐘。96孔板每5 μL反應系統加2 ul 0.125 mol/L EDTA-Na2溶液，33 μL 85%乙醇，蓋上矽膠墊，充分振盪3分鐘，在4℃下以3000 g離心30分鐘。離心結束後取出定序板，打開矽膠墊，將定序反應板倒置吸水紙上，倒離心至離心力達到185 g時立即停止。96孔板每孔加50 ul 70%乙醇，蓋上矽膠墊，振盪1.5分鐘，在4℃下以3000 g離心15分鐘。定序反應板置避光通風處30分鐘，風乾至無乙醇氣味。96孔板每孔加10 μL(384孔板每孔加8 μL) HI-DI甲醯胺，蓋封口膜，振盪5秒後離心至1000 rpm。 5.　定序結果和分析
    純化後的定序反應產物在ABI 3730XL上進行毛細管電泳定序，定序峰圖經過uType軟體(Invitrogen)分析(圖5)，得到HLA分型結果。全部檢測結果與原有檢測結果相同(表5)。
    實施例3　對950個樣本的HLA-A/B/C 2、3、4號外顯子和HLA-DQB1 2、3號外顯子的基因分型
    在本發明的實施例中，採用基於引子標籤、DNA不完全打斷、基因庫標籤及PCR-FREE建庫Illumia GA Pair-End的定序方法，同時對950個樣本的HLA-A/B/C 2、3、4號外顯子和HLA-DQB1 2、3號外顯子(PCR產物長度大小處於300 bp-500 bp之間)的基因分型，證明該策略可以實現對超過定序儀本身測長以上的基因片段進行基因分型，同時證明該發明能夠實現低成本、高通量、高準確率和高解析度的HLA基因分型。
    原理：將待分析的樣本平均分成10組，對每組樣本通過PCR反應在HLA-A/B/C 2、3、4號外顯子和HLA-DQB1 2、3號外顯子的PCR產物兩端引入引子標籤，使其特異的標記PCR產物的樣本資訊。將各組內樣品的HLA-A/B/C/DQB1四個基因座的PCR擴增產物等體積混合在一起，獲得PCR產物基因庫；所得PCR產物基因庫經過超音波不完全打斷後，構建不同的PCR-Free標籤定序基因庫(其中每一組樣本的PCR產物基因庫使用一種不同的轉接子，從而構建10個標籤定序基因庫)；將10個標籤定序基因庫等莫耳混合在一起構建混合標籤定序基因庫，混合標籤定序基因庫經2%低熔點瓊脂糖電泳，割膠純化回收位於450-750 bp長度範圍之間的所有DNA條帶。回收的DNA經Illumina GA PE-100定序。通過基因庫標籤和引子標籤序列可以找到所有所測樣本的序列資訊，再通過已知DNA片段的參考序列資訊和DNA片段序列之間的重疊和連鎖關係組裝出整個PCR產物的序列，再通過與HLA-A/B/C/DQB1相應外顯子的標準資料庫的比對結果可組裝出原PCR產物的全序列，實現HLA-A/B/C/DQB1的基因分型。 1.　樣本抽取
    使用KingFisher自動抽取儀(美國Thermo公司)從950份已知HLA-SBT分型結果的血樣品[中國造血幹細胞捐獻者資料庫(以下稱“中華骨髓庫”)]中抽取DNA。主要步驟同實施例1。 2.　PCR擴增
    把樣本抽取步驟中所得的950份DNA依次編號1-950，均分成10組，每組95份DNA，分別標記為HLA-1、HLA-2、HLA-3、HLA-4、HLA-5、HLA-6、HLA-7、HLA-8、HLA-9、HLA-10。對每組樣本分別以95套帶有雙向引子標籤(表3)用於擴增HLA-A/B 2、3、4號外顯子(表6)，HLA-C 2、3、4號外顯子(表2)和HLA-DQB1 2、3號外顯子的PCR引子(表7)來分別擴增95份DNA樣本。PCR反應在96孔板中進行，共100板，編號分別為HLA-X-P-A2、HLA-X-P-A3、HLA-X-P-A4、HLA-X-P-B2、HLA-X-P-B3、HLA-X-P-B4、HLA-X-P-C2、HLA-X-P-C3、HLA-X-P-C4以及HLA-X-P-DQB1(“X”表示樣本組號資訊1/2/3/4/5/6/7/8/9/10，“A2/3/4、B2/3/4、C2/3/4、DQB1”表示擴增的基因座)，每板內設置一個不添加模版的陰性對照，陰性對照所用引子為PI-1(表3)標記的引子。實驗的同時，記錄下每個樣本對應的樣本組號資訊和引子標籤資訊。例如PI-1和PI-2引子標籤的相關資訊如下，其他依次類推。

    HLA-A/B/C的PCR程序和PCR反應系統如下，所使用用於擴增HLA-A/B相應外顯子的PCR引子如表6所示，所使用用於擴增HLA-C相應外顯子的PCR引子如表2所示。
    96℃　2分鐘
    95℃　30秒→60℃　30秒→72℃　20秒(32個循環)
    15℃　靜置
    HLA-A/B/C的PCR反應系統如下所有試劑均購自普洛麥格(北京)生物技術有限公司(Promega)。
    HLA-DQB1的PCR程序如下，所使用用於擴增HLA-DQB1相應外顯子的PCR引子如表5所示。
    96℃　2分鐘
    95℃　30秒→55℃　30秒→72℃　20秒(32個循環)
    15℃　靜置
    HLA-DQB1的PCR反應系統如下：
    其中PInf-A/B/C-F2/3/4和PInf-Q-F2/F3表示引子5’末端帶有第n號正向引子標籤序列(表3)的HLA-A/B/C/DQB1的F引子，PInr-A/B/C-R2/3/4和PInr-Q-R2/R3表示引子5’末端帶有第n號反向引子標籤序列的HLA-A/B/C/DQB1的R引子(此處n≦95)，其它依次類推。且每個樣本對應特定的一套PCR引子(PInf-A/B/C-F2/3/4,PInr-A/B/C-R2/3/4,PInf-Q-F2/F3,PInr-Q-R2/R3)。
    PCR反應在Bio-Rad公司的PTC-200 PCR儀上運行。PCR完成後，取3 ul PCR產物經2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。圖6顯示了1號樣本HLA-A/B/C/DQB1相應外顯子PCR產物電泳結果，DNA分子標記為DL 2000(Takara公司)，膠圖上有一系列片段大小為300 bp-500 bp單一條帶，表明1號樣本的HLA-A/B/C/DQB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、C2、C3、C4、DQB1) PCR擴增成功，陰性對照(N)無擴增條帶。其它樣品的結果與此類似。 3.　PCR產物混合和純化
    對第“X”組(“X”為1/2/3/4/5/6/7/8/9/10)樣本，從96孔板HLA-X-P-A2剩餘的PCR產物中(陰性對照除外)各取20 ul混合在一個3 ml的EP管中，標記為HLA-X-A2-Mix，對第“X”組樣本的其它9個96孔板進行同樣的操作，分別標記為HLA-X-A3-Mix、HLA-X-A4-Mix、HLA-X-B2-Mix、HLA-X-B3-Mix、HLA-X-B4-Mix、HLA-X-C2-Mix、HLA-X-C3-Mix、HLA-X-C4-Mix和HLA-X-DQB1-Mix，震盪混勻，從HLA-X-A2-Mix、HLA-X-A3-Mix、HLA-X-A4-Mix、HLA-X-B2-Mix、HLA-X-B3-Mix、HLA-X-B4-Mix、HLA-X-C2-Mix、HLA-X-C3-Mix、HLA-X-C4-Mix和HLA-X-DQB1-Mix中各取200 ul混合在一個3 ml的EP管中，標記為HLA-X-Mix，從中各取500 ul DNA混合物經Qiagen DNA Purification kit管柱純化(具體純化步驟詳見說明書)，純化所得的200 ul DNA，經Nanodrop 8000(Thermo Fisher Scientific公司)測定的DNA濃度，其它9組樣本操作相同，10組樣本測定的DNA濃度分別為：
    4.　Illumina GA定序基因庫構建
    如實施例1所述的方法，從純化後的HLA-X-Mix中各取總量5 ug的DNA分別進行DNA打斷，打斷後純化，末端修復反應，3’末端加A反應，連接Illumina GA PCR-Free基因庫轉接子(adapter)。
    樣本組與基因庫轉接子的對應關係如下：
    反應產物經Ampure Beads(Beckman Coulter Genomics)純化後溶於50ul去離子水，經螢光定量PCR(QPCR)檢測到DNA莫耳濃度結果如下：
    5.　割膠回收
    將HLA-1-Mix、HLA-2-Mix、HLA-3-Mix、HLA-4-Mix、HLA-5-Mix、HLA-6-Mix、HLA-7-Mix、HLA-8-Mix、HLA-9-Mix和HLA-10-Mix等莫耳混合(終濃度70.86 nM/ul)，標記為HLA-Mix-10，取30 μL HLA-Mix-10用2%低熔點瓊脂糖膠進行回收。電泳條件為100V，100分鐘。DNA marker為NEB公司的50 bp DNA marker。割膠回收450-750 bp長度範圍的DNA片段(圖7)。膠回收產物經QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN公司)回收純化，純化後體積為32 ul，經螢光定量PCR(QPCR)檢測到DNA濃度結果為10.25 nM。 6.　Illumina GA定序和結果分析
    根據實施例1的方法，進行定序和結果分析。
    建立各個引子標籤對應樣本HLA-A/B/C/DQB1各外顯子PCR產物定序結果的資料庫，所得DNA序列利用與IMGT HLA專業資料庫中HLA-A/B/C/DQB1相應各外顯子的序列資料庫比對，序列比對結果100%匹配的即為對應樣本的HLA-A/B/C/DQB1基因型。可參考圖8例示說明的1號樣品的HLA-C基因座的2號外顯子一致性序列構建程序的截圖。所有950個樣本，得到的分型結果與原已知分型結果完全相符，其中1-32號樣本的具體結果如下：



    註：當遇到HLA-A/B/C基因座中2、3、4號外顯子序列完全相同的結果時，取常見型。
    採用本發明的技術路線，對950份已知HLA-SBT分型結果的樣本進行HLA-A/B/C/DQB1基因座的基因分型，結果發現：採用本發明的技術路線所得的分型結果與原結果完全一致。
    對於本領域熟習此項技術之人士顯而易見的是，在不背離本發明的範圍和精神的前提下可對本發明進行各種修改和變動。通過考慮本發明在此所公開的說明書和實例，本發明的其他實施方案對本領域熟習此項技術之人士來說是顯而易見的。本說明書和實施例應僅看作例示性用途，本發明真正的範圍和精神在所附的申請專利範圍中說明。 參考文獻
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    <212>　DNA
    <213>　人工的序列
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    <223>　用於PCR的HLA-C基因的2號外顯子正向引子
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    圖1為實施例1中，部分樣本的HLA-C 2、3、4號外顯子PCR產物電泳結果，從電泳圖上看，PCR產物片段大小分別為位於400-500 bp之間的單一條帶，其中泳道M是DNA標準分子量參照物(DL 2000，Takara公司)；
    圖2顯示實施例1中，對HLA-Mix打斷後DNA電泳凝膠割膠的情況，割膠區域為450-750 bp區域。其中泳道M是分子量標準物(NEB-50bp DNA Ladder)，泳道1顯示割膠前HLA-Mix的膠圖，泳道2顯示割膠後HLA-Mix的膠圖；
    圖3顯示實施例1中，2號樣品的HLA-C基因座的2號外顯子一致性序列構建程序截圖。首先，該樣本的C基因座的定序序列通過BWA軟體比對到參考序列上，分別構建出該樣本C基因座2、2、4號外顯子的一致性序列，再根據SNP之間的連鎖關係來確定C基因座各外顯子的單體型序列，最後，由各外顯子單體型序列的交集確定該樣本的型。如圖所示，在2號樣本C基因序列695-764區域含有2個雜合SNP，由read1和read2可確定SNP連鎖關係分別為：A-C,G-A(圖中的“…”表示與參考序列相同的鹼基)。其序列分別對應C*010201和C*07020101型序列的陰影部分。其它區域的連鎖關係的判定與此類似；
    圖4顯示實施例2中，26份樣本HLA-C基因座2、3和4號外顯子PCR產物電泳圖。26份樣本HLA-C基因座2、3和4號外顯子PCR產物電泳圖，如圖中所示，所有PCR產物均小於500 bp，且電泳條帶單一，無明顯的非特異性條帶，同一對引子對於各樣本的擴增效率均一；
    圖5顯示實施例2中，擴增1號模版PCR產物定序峰圖經uType軟體分析的結果，左側結果輸出欄中顯示結果C*08:01:01 C*15:05:01，與1號模版原已知型相同；
    圖6為實施例3中，1號樣本HLA-A/B/C/DQB1相應外顯子PCR產物電泳結果，從電泳圖上看，PCR產物為一系列片段大小300 bp-500 bp的單一條帶，其中泳道M是分子量標記物(DL 2000，Takara公司)，泳道1-10為1號樣本的HLA-A/B/C/DQB1各外顯子(A2、A3、A4、B2、B3、B4、C2、C3、C4、DQB1) PCR擴增產物，陰性對照(N)無擴增條帶。其它樣品的結果與此類似；
    圖7為實施例3中，HLA-1-Mix、HLA-2-Mix、HLA-3-Mix、HLA-4-Mix、HLA-5-Mix、HLA-6-Mix、HLA-7-Mix、HLA-8-Mix、HLA-9-Mix和HLA-10-Mix經等莫耳混合後的瓊脂糖膠回收結果。其中泳道M是分子量標記物，泳道1為混合物的電泳結果，泳道2為對450-750 bp長度範圍DNA片段切膠回收後的電泳圖；以及
    圖8顯示實施例3中，1號樣品的HLA-C基因座的2號外顯子一致性序列構建程序截圖。首先，該樣本的C基因座的定序序列通過BWA軟體比對到參考序列上，分別構建出該樣本C基因座2、2、4號外顯子的一致性序列，再根據SNP之間的連鎖關係來確定C基因座各外顯子的單體型序列，最後，由各外顯子單體型序列的交集確定該樣本的型。如圖所示，在1號樣本C基因序列695-764區域含有2個雜合SNP，由read1和read2可確定SNP連鎖關係分別為：A-C,G-A(圖中的“…”表示與參考序列相同的鹼基)。其序列分別對應C*010201和C*07020101型序列的陰影部分。其它區域的連鎖關係的判定與此類似。
    权利要求:
    Claims (18)
    [1] 一種具有如序列辨識編號：1、序列辨識編號：2、序列辨識編號：3、序列辨識編號：4、序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7、序列辨識編號：8、序列辨識編號：9、序列辨識編號：10、序列辨識編號：11、序列辨識編號：12中任一項所示序列的多核苷酸。
    [2] 一種HLA-C基因2、3和/或4號外顯子擴增方法，其特徵在於使用選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2；序列辨識編號：3和序列辨識編號：4；序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對進行PCR擴增，擴增HLA-C基因2、3和/或4號外顯子。
    [3] 一種對樣品中HLA-C基因2、3和/或4號外顯子進行定序的方法，其包括下列步驟：(1)　提供一個樣品並抽取該樣品的DNA；(2)　將選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2；序列辨識編號：3和序列辨識編號：4；序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對用於擴增該DNA從而得到PCR產物；以及(3)　對該PCR產物進行定序。
    [4] 如申請專利範圍第3項的方法，其中於步驟(2)中所得到的該PCR產物被進一步進行一純化處理。
    [5] 如申請專利範圍第3項的方法，其中該樣品是血樣品。
    [6] 如申請專利範圍第5項的方法，其中該血樣品是來自於哺乳動物或人類。
    [7] 一種HLA-C基因分型方法，其包括：(1)　使用選自於序列辨識編號：1和序列辨識編號：2；序列辨識編號：3和序列辨識編號：4；序列辨識編號：5和序列辨識編號：6，或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的引子對進行PCR擴增，擴增待測樣本的HLA-C基因2、3和/或4號外顯子；以及(2)　對擴增出的外顯子進行定序，並將定序結果與資料庫中的標準序列進行比較，從而確定基因分型結果。
    [8] 如申請專利範圍第3項的方法，其中該定序是通過Sanger定序法，或者是通過第二代定序法。
    [9] 如申請專利範圍第7項的方法，其中該定序是通過Sanger定序法，或者是通過第二代定序法。
    [10] 如申請專利範圍第8項的方法，其中該第二代定序法是Illumina Solexa或Roche454。
    [11] 如申請專利範圍第9項的方法，其中該第二代定序法是Illumina Solexa或Roche454。
    [12] 如申請專利範圍第2至11項中任一項的方法，其中還包括使用其它HLA基因擴增引子進行PCR擴增。
    [13] 一種用於進行HLA-C基因分型的試劑盒，該試劑盒中包括序列辨識編號：1和序列辨識編號：2、序列辨識編號：3和序列辨識編號：4、序列辨識編號：5和序列辨識編號：6；或者序列辨識編號：7和序列辨識編號：8、序列辨識編號：9和序列辨識編號：10、序列辨識編號：11和序列辨識編號：12的PCR擴增引子對。
    [14] 如申請專利範圍第13項的試劑盒，其中還包括用於DNA擴增、DNA純化和/或DNA定序的試劑。
    [15] 如申請專利範圍第14項的試劑盒，其中還包括其它HLA基因擴增引子。
    [16] 如申請專利範圍第1項的多核苷酸用於HLA-C基因分型的用途。
    [17] 如申請專利範圍第7項的方法用於HLA-C基因分型的用途。
    [18] 如申請專利範圍第13項的試劑盒用於HLA-C基因分型的用途。
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    CN103261438B|2015-09-16|
    TWI542696B|2016-07-21|
    HK1185114A1|2014-02-07|
    CN103261438A|2013-08-21|
    WO2012083505A1|2012-06-28|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US7300755B1|2003-05-12|2007-11-27|Fred Hutchinson Cancer Research Center|Methods for haplotyping genomic DNA|
    US20100261189A1|2008-10-03|2010-10-14|Roche Molecular Systems, Inc.|System and method for detection of HLA Variants|
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    法律状态:
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    申请号 | 申请日 | 专利标题
    PCT/CN2010/002149|WO2012083505A1|2010-12-24|2010-12-24|Hla-c基因分型的方法及其相关引物|
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